Protocole d’utilisation du test GenoType® MTBDRplus
Hain Lifescience (version 2.0)

Le test GenoType® MTBDRplus permet après amplification, l’identification du complexe M. tuberculosis et la détection des résistances à la rifampicine et/ou à l’isoniazide d'une mycobactérie du complexe tuberculosis cultivée sur un milieu liquide ou solide. Ce test peut aussi être réalisé directement à partir d'un prélèvement pulmonaire présentant un examen direct positif ou négatif.

Rq. Le test GenoType® MTBDRsl permet de détecter les résistances aux fluoroquinolones et/ou aux aminoglycosides et/ou à l'éthambutol. Après amplification, il faudra suivre la même procédure décrite pour le kit MTBDRplus, sauf pour les conditions d’amplification qui diffèrent depuis la version 2.0 de MTBDRplus.

PREPARATION DE L'ADN

L'espace de travail doit être exempt de toute trace d'ADN amplifié (pièce « grise »).
Lire attentivement la procédure « Mise en place du test amplification » à suivre rigoureusement pour éviter les contaminations.

La version MTBDRplus 2.0 est vendue avec le kit de préparation de l’ADN « GenoLyse ».

Protocole du kit GenoLyse :

  1. À partir de prélèvements cliniques, utiliser 500µl d'échantillon décontaminé (les échantillons doivent être traités par NALC/NaOH). Centrifuger pendant 15mn à 10000 x g sur une centrifugeuse de paillasse à l'aide d'un rotor protégeant contre les aérosols dans un environnement sécurisé de classe II. Jeter le surnageant et reprendre le culot dans 100 µl d'eau. Vortexer.
  1. Ensuite, incuber les bactéries 20mn à 95°C (bain-marie bouillonnant).
  1. Centrifuger 5mn à vitesse maximale. Utiliser directement 5 µl de surnageant pour la PCR. Si la solution d'ADN doit être conservée de façon prolongée, transférer le surnageant dans un nouveau tube.

AMPLIFICATION

Préparer le mélange réactionnel dans une pièce exempte d'ADN (pièce « blanche »). Lire attentivement la procédure « Mise en place du test amplification » à suivre rigoureusement pour éviter les contaminations.

MTBDRplus version 2.0 :

  • Distribuer dans chaque tube :
    • 10 μl Amplification Mix A (AM-A)
    • +35 μl Amplification Mix B (AM-B)
    • Mélanger doucement avec la pipette
  • Sortir de la « pièce blanche » avec les tubes de mélange sur un portoir jetable.
  • Dans la « pièce grise », ajouter dans chaque tube 5µl de l’ADN à tester extrait par la méthode GenoLyse pour la version 2.0.

Centrifuger brièvement

Profil d'amplification

AMPLIFICATION

Échantillons cliniques

Cultures

15 mn à 95°C

1 cycle

 

30 sec à 95°C
2 mn à 65°C

20 cycles

10 cycles

25 sec à 95°C
40 sec à 50°C
40 sec à 70°C

30 cycles

20 cycles

8 mn à 70°C

1 cycle

 

Les produits d’amplification peuvent être stockés à +8°C to 20°C.

Les amplicons produits présentent des longueurs respectives de 63bp (contrôle d'amplification), de 115bp (complexe M. tuberculosis), de 166bp (rpoB), de 20bp (katG) et de 110bp (inhA). L’électrophorèse sur gel d’agarose est optionnelle.

HYBRIDATION

L’hybridation se pratique dans la pièce de manipulation de l’ADN amplifié « pièce noire ».
Lire attentivement la procédure « Mise en place du test amplification » à suivre rigoureusement pour éviter les contaminations.

Préparation

  • Préchauffer le bain-marie agitateur/Twincubator à 45°C (dérivation maximale : +/-1°C).
  • Préchauffer les solutions HYB et STR à 27-45°C avant utilisation. Les réactifs ne doivent présenter aucun précipité (à noter cependant que la solution CON-D est opaque). Si besoin, agiter.
  • Laisser les autres réactifs (à l'exception des solutions CON-C et SUB-C) à température ambiante.
  • Dans un tube approprié, diluer le Conjugué Concentré (CON-C, orange) et le Substrat Concentré (SUB-C, jaune) au 1:100 dans un volume adéquat du tampon correspondant (CON-C avec CON-D, SUB-C avec SUB-D). Bien homogénéiser et laisser à température ambiante. Pour chaque échantillon testé, ajouter 10µl de concentré à 1ml de tampon. Diluer CON-C avant chaque utilisation. Une fois dilué, SUB-C reste stable pendant 4 semaines conservé à température ambiante et à l'obscurité.
  • Déposer 20µl de Solution de Dénaturation (DEN, bleu) à une extrémité de chaque puits utilisé.
  • Ajouter 20µl d'échantillon amplifié et mélanger les deux solutions par pipetages répétés. Incuber 5mn à température ambiante.
  • Pendant ce temps, à l'aide d'une pince, sortir du tube le nombre approprié de bandelettes (STRIPS), et inscrire au crayon leur numéro d'identification dans l'espace situé sous le marquage coloré. Toujours porter des gants pour manipuler les bandelettes.
  • Ajouter dans chaque puits 1ml de Tampon d'Hybridation (HYB, vert) préchauffé et homogénéisé. Doucement agiter le bac jusqu'à ce que le mélange prenne une coloration homogène. Eviter les éclaboussures vers les autres puits.
  • Déposer une bandelette dans chaque puits utilisé.
    Les bandelettes doivent être entièrement recouvertes par le liquide, avec la face marquée (identifiable par le marquage coloré) tournée vers le haut. Les bandelettes mal orientées doivent être remises en position à l'aide de pincettes propres. Afin d'éviter toute contamination, bien nettoyer les pincettes après chaque utilisation. Cela vaut aussi pour toutes les étapes suivantes.
  • Placer le bac dans bain-marie agitateur/TwinCubator et incuber 30mn à 45°C.
    Pour le bain-marie agitateur, sélectionner une fréquence d'agitation suffisante pour assurer un bon brassage du tampon. Ajuster le niveau de l'eau dans le bain-marie agitateur au moins à un tiers de la hauteur du bac de façon à assurer un bon transfert de chaleur. Cela vaut aussi pour toutes les étapes suivantes.
  • Aspirer le Tampon d'Hybridation
    Utiliser par exemple une pipette Pasteur reliée à une pompe vide.
  • Ajouter à chaque puits 1ml de Solution de Lavage Stringent (STR, rouge) et incuber 15mn à 45°C dans le bain-marie agitateur/TwinCubator.
  • A partir de cette étape, travailler à température ambiante.
    Vider la Solution de Lavage Stringent. Eliminer tout le liquide résiduel en retournant la plaque sur du papier absorbant (effectuer de même pour les autres étapes du lavage).
  • Laver chaque puits avec 1ml de Solution de Rinçage (RIN) et incuber pendant 1mn sous agitation (TwinCubator/plateau agitateur). Vider la Solution de Rinçage par retournement de la plaque sur un container à déchets.
  • Ajouter à chaque puits 1ml de Conjugué dilué (voir ci-dessus) et incuber 30 mn sous agitation (TwinCubator/plateau agitateur).
  • Vider le contenu des puits et rincer sous agitation 1mn à l'aide de 1ml de Solution de Rinçage (RIN). Vider RIN. Répéter ce rinçage une nouvelle fois, puis rincer une fois avec environ 1ml d'eau distillée à l'aide d'une pissette. Bien éliminer toute trace d'eau dans les puits après cette première étape.
  • Ajouter 1ml de Substrat dilué (voir ci-dessus) dans chaque puits et incuber sans agitation à l'obscurité (recouvrir d’un papier d’aluminium). Le temps de révélation peut varier en fonction des conditions de déroulement du test (de 3 à 20 mn), notamment de la température de la pièce. Des temps de révélation trop longs peuvent entraîner un bruit de fond qui peut gêner l'interprétation des résultats.
  • Arrêter la réaction en rinçant brièvement deux fois à l'eau distillée.
  • A l'aide de pincettes, récupérer les bandelettes et les sécher entre deux couches de papier absorbant.
  • Scotcher les bandelettes sur la feuille de résultats
  • Lecture et interprétation selon les abaques